PROSEDUR STANDAR DALAM MIKROTEKNIK

Untuk prosedur rutin, sayat paraffin dan pewarnaan hematoksilin eosin, tahap-tahap utama prosesing jaringan yang harus ditempuh ditampilkan dalam skenario umum dibawah ini :

1.      Pembiusan dan Pengambilan (Koleksi Jaringan)

Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar(endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya.

Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:

·         Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing

·         Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.

Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.

Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). Dalam pengambilan jaringan kita menggunakan alat-alat  bedah sperti gunting bedah, pinset, pipet, dan lain-lain.

2.      Fiksasi

Fiksasi artinya membuat menjadi tetap (to fix).Fiksasi artinya tahap pertama dan paling kritis dalam prosesing preparat histologi.Tahap ini menjadi kritis karena begitu dikoleksi (dipisahkan dari tubuh asalnya), sel-sel jaringan akan segera mengalami perubahan baik karena aktivitas bakteri maupun karena proses autolisis (self-digestion) oleh enzim-enzim yang terdapat dalam sel.

Tujuan-tujuan fiksasi adalah sebagai berikut :

a.       Menghentikan proses-proses metabolik sel secara cepat

b.      Mencegah terjadinya perubahan-perubahan yang bersifat regresif

c.       Mengawetkan bahan-bahan sitologis dan histologis

d.      Mempertahankan bentuk aktual bahan histologis

e.       Mengeraskan, atau aka memberi konsistensi kepada bahan-bahan yang lembut.

f.       Memberi kemungkinan adanya perbedaan optik diantara jaringan.

Untuk dapat mencapai tujuan tersebut diatas, suatu bahan fiksatif harus memiliki sifat-sifat sebagai berikut:

a.       Memiliki daya penetrasi yang baik ke dalam jaringan

b.      Mampu mengkoagulasi isi sel dengan baik

c.       Mampu melindungi jaringan terhadap terjasinya penyusutan atau distorsi yang mungkin akan terjadi selama dehidrasi

d.      Mampu membuat isi atau bagian sel menjadi tampak berbeda.

Sangat jarang digunakan fikasatif  yang berasal dari bahan tunggal kecuali formalin dan glutaral dehida.Fiksatif yang umum biasanya berupa campuran atau kombinasi atau kombinasi beberapa bahan. Fiksatif yang paling efektif adalah kombinasi koagulan dan non koagulan protein.Fiksatif campuran yang  paling efektif digunakan adalah larutan Bouin.

Fiksatif tunggal – Bahan pembuatan fiksatif campuran

            Bahan-bahan kimia di bawah ini pada awalnya digunakan sebagai fiksatif tunggal. Tetapi pada perkembangan selanjutnya bahan-bahan tersebut, kecuali beberapa bahan tertentu, sudah jarang digunakan secara sendirian tetapi dijadikan sebagai salah satu komponen dari fiksatif campuran.

a.       Asam asetat

b.      Aseton

c.       Kromium trioksida (CrO₃), asam kormat

d.      Alkohol

e.       Aldehida (HCHO)

f.       Merkuri klorida (HgCl₂)

g.      Osmium tetroksida (OsO₄), asam osmat

h.      Asam pikrat (C₆H₂(NO₂)₃OH)

i.        Kalium dikromat (K₂Cr₂O₇₎

j.        Asam trikloroasetat (CCl₃COOH)

Fiksatif campuran-Kombinasi beberapa fiksatif tunggal

a.       Larutan Mueller                                        k. Larutan Gilson

b.      Larutan Orth                                             l. Larutan Bensey AOB

c.       Larutan Zenker                                         m. Larutan Regaud

d.      Larutan Helly (Formol Zenker)                 n. Larutan Bianco

e.       Larutan Heidenhain                                  o. Larutan Gate

f.       Larutan Lavdowsky                                  p. Larutan Navashin

g.      Formalin                                                    q. Larutan Carnoy

h.      Larutan Mann                                           r. Larutan Alkohol-   

      Formalin-Asetat (A-F-A)

i.        Larutan Bouin                                           s. Larutan Kolmer

j.        Larutan Allen B                                        t. Larutan Petrunkewitsch

Jika fiksasi tidak bisa segera dilakukan, maka ada baiknya jika jaringan dimasukkan ke dalam lemari pendingin (refrigerator) dengan tujuan untuk meminimalkan terjadinya autolisis dan putrefaksi sampai jaringan dapat difiksasi.

Beberapa pertimbangan yang harus dilakukan dalam proses fiksasi jaringan yaitu :

a.       Pemilihan fiksatif adalah tujuan pengamatan yang akan dicapai dalam pembuatan preparat histologi tersebut.

b.      Efek pengerasan jaringan yang ditimbulkan oleh fiksatif.

c.       Volume fiksatif yang digunakan.Gunakan fiksatif dengan volume paling sedikit 10 kali volume jaringan.

d.      Waktu yang dibutuhkan untuk memfiksasi jaringan sangat tergantung kepada daya penetrabilitas dan aksi fiksatif.

3.      Pencucian (Washing) Prafiksasi dan Postfiksasi

a.       Pencucian prafiksasi

Pencucian jaringan segar ini ditujukan untuk menghilangkan bekas-bekas darah yang mungkin menempel pada jaringan ketika koleksi jaringan.Menempelnya darah atau kotoran lain pada permukaan jaringan  akan menimbulkan efek-efek yang tidak diinginkan pada tahap-tahap berikutnya.Disamping itu, kotoran darah ini juga bisa menimbulkan artifak yang akan mempengaruhi hasil pengamatan.

Jaringan segar yang baru diambil dari hewan, sebaiknya dicuci terlebih dahulu dengan laruta salin atau larutan buffer sbelum difiksasi. Larutan salin normal akan mencegah terjadinya perubahan osmotik dan plasmolitik, sementara larutan buffer akan mempertahankan keseimbangan asam dan basa protoplasma disamping kemampuan untuk mencegah terjadinya perubahan osmotik dan plasmolitik, atau perubahan postmortem lainnya.

b.      Pencucian Postfiksasi

Pencucian jaringan postfiksasi harus dilakukan untuk membuang kelebihan fiksatif yang mungkin dapat menimbulkan interfrensi pada tahap berikutnya.Jika sayatan beku akan dilakukan, maka jaringan dapat dicuci dengan air, tetapi dalam keadaan mendesak jaringan tersebut dapat dimasukkan langsung kedalam mikrotom beku tanpa dicuci terlebih dahulu.

Pencucian dengan air harus dilakukan jika jaringan difiksasi dengan fiksatif yang mengandung kaliun dikromat, merkuri klorida, asam osmat, atau dalam larutan mueller, Zenker, dan lain-lain.

Pencucian dengan alkohol harus dilakukan jika jaringan difiksasi dengan fiksatif yang mengandung formalin,larutan Bouin, Mann, Ezra Allen, AFA dan juga larutan carnoy.

Untuk jaringan yang difiksasi kurang dari 12 jam, lama pencucian sebaiknya dua kali lipat dari waktu yang dibutuhkan untuk fiksasi.

4.      Dehidrasi (Dehydration)

Tujuan dehidrasi adalah untuk menarik air yang terdapat dalam jaringan setelah difiksasi.Dehidrasi juga memiliki fungsi mencuci dan bisa membuat jaringan menjadi kokoh dan mungkin menjadi keras dan rapuh.Proses dehidrasi dilakukan dengan cara melewatkan jaringan melalui satu seri larutan yang mengandung bahan penarik air dengan konsentrasi naik dan air dengan konsentrasi menurun.

Larutan pendehidrasi (Dehydrating Agent)

1.      Alkohol

2.      Dioksan

3.      N-butil Alkohol

5.      Penjernihan (Clearing)

Penjernihan merupakan tahap transisi dari alkohol ke paraffin dalam metode paraffin.Bahan yang paling umum digunakan merupakan bahan hidrokarbon, seperti xilol, dan toluol,serta klorform.Ada beberapa cara penjernihan ( clearing) yaitu :

a.       Penjernihan dengan xilol dan toluol

b.      Penjernihan dengan kloroform

c.       Penjernihan dengan minyak cedar atau metil salisilat

6.      Infiltrasi (Infiltration)

Infiltrasi adalah tahap yang sangat penting dan kritis, karena tahap ini sangat menentukan kualitas hasil penyayatan (sectioning).Dalam proses ini, medium imbeding diinfiltrasikan ke dalam seluruh bagian jaringan.

Jika parafin akan digunakan sebagai medium embeding, maka infiltrasi jaringan dilakukan dengan cara memindahkannya secara berturut-turut ke dalam paraffin lembut dengan titik leleh 48^oC, paraffin menengah dengan titik leleh 52-54^oC, dan terakhir ke dalam paraffin keras, dengan titik leleh 56^oC masing-masing sleama 15    menit.  

7.      Penanaman (Embedding atau Blocking)

Tahapan penanaman disebut juga dengan blocking (membuat block).Untuk membuat block yang terbentuk diperlukan suatu cetakan atau (template).Ukuran blok yang terbentuk ditentukan oleh ukuran cetakan yang digunakan.Ada beberapa jenis cetakan :

a.       Cetakan yang berbentuk huruf L

b.      Cetakan yang bisa dirangkai seperti sarang lebah

c.       Cetakan yang terbuat dari bahan  gelas

d.      Cetakan yang terbuat dari bahan kertas

8.      Penyayatan (Sectioning)

Tujuan utama penyayatan adalah untuk menghasilkan irisan atau sayatan jaringan setipis mungkin tanpa merusak struktur umum jaringan tersebut.Untuk menghasilkan sayatan seperti ini dibutuhkan peralatan khusus yang disebut mikrotom.Ada beberapa metode penyayatan diantaranya :

a.       Metode parafin

b.      Metode celloidin

c.       Metode kombinasi celloidin-paraffin

d.      Metode beku

9.      Penempelan (Afixxing)

Untuk slide konvensional, agar pita sayatan dapat menempel dengan erat dibutuhkan suatu reagen tertentu yang berfungsi sebagai lem yang melekatkan pita pada permukaan slide.Tahap penempelan harus dilakukan sedemikian rupa hingga kilta yakin bahwa pita sayatan benar-benar menempel pada slide.Bahan yang pertama kali diperkenalkan adalah albumen dan gliserol dengan perbandingan (1:1).

Membersihkan slide

Slide dapat dibersihkan dengan merendamnya di alkohol netral kemudian dikeringkan dengan kain lap linen yang kering dan bersih.Jika slide sulit dibersihkan dengan cara diatas maka rendam dengan alkohol 70% yang telah diasamakan dengan asam nitrit, kemudian dengan alkohol netral dan dikeringkan seperti dijelaskan diatas.Slide bekas dapat di daur ulang dengan cara merendamnya denga larutan xilol yang dutujukan untuk melarutkan canada balsam sehingga kaca penutupnya terlepas dari slide.Cara lain untuk melepaskan kaca penutup slide adalah memanaskan slide di atas nyala api hingga balsam meleleh, sesudah kaca penutup slide dilepas dengan cara menggesernya secara perlahan menggunakan ujun skalpel.

10.  Pewarnaan (Staining)

Pewarnaan sangat diperlukan karena kebanyakan jaringan sudah tidak memiliki warna yang memadai untuk dapat diamati komponen-komponennya dibawah mikroskop.Pemillihan bahan pewarna yang tepat akan sangat membantu dalam identifikasi jaringan dan komponen-komponennya serta mendiagnosis kondisi-kondisi patologisnya.

Bahan pewarna berdasarkan asal-usulnya terbagi menjadi 2 yaitu :

a.       Pewarna alami

Pewarna ini diperoleh dari hewan dan tumbuhan contohnya kokinal, carmine , dan hematoksisilin.

b.      Pewarna sintetik

Kelebihan pewarna sintetika adalah bahwa pewarna ini dapat digunakan untuk pewarnaan ganda atau triple.

Prosedur pewarnaan dengan hematoksilin :

Xilol 1 à Xilol 2 à Xilol : Alkohol absolut (1:1) àAlkohol absolut à 95% à 80% à 70% à 50% à Akuades à Hematoksilin à Air ledeng mengalir (dua kali ganti) à Akuades (2 kali ganti) à Eosin à Alkohol 70% à Alkohol 80% à  Alkohol (96%) à Xilol 1 à Xilol 2 à Menutup.

11.  Penjernihan (Clearing)

Tahap penjernihan ini adalah tahap yang kedua kali.Tahap penjernihan ini sama seperti tahap penjernihan yang pertama. Bahan penjernih yang paling umum digunakan merupakan bahan hidrokarbon, seperti xylol (xylene) dan toluol (toluene), serta kloroform.

12.  Penutupan (Mounting atau Cover Slipping)

Penutupan dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut :

a.       Bentangkan satu kajang kertas filter di atas meja tempat anda bekerja

b.      Ambil satu slide dari xilol II kemudian diletakkan di atas kertas filter (permukaan yang mengandung jaringan menghadap ke atas).

c.       Teteskan satu Canada balsam tepat di atas jaringan sebelum jaringan kering dari xilol.

d.      Ambil satu kaca penutup di antara jari telunjuk dengan jempol tangan kiri sementara tangan kanan memegang sebuah jarum.

e.       Turunkan kaca penutup sampai menyentuh slide dekat jaringan lalu miringkan ke arah kanan dan tahan ujungnya yang lain dengan jarum.

f.       Turunkan kaca penutup dengan caara menarik ujung jarum secara perlahan.

g.      Biarkan Canada balsam menyebar secar merata di bawah kaca penutup untuk mendesak gelembung udara dari bawah kaca penutup tersebut.

h.      Biarkan slide mengering dan jangan lagi disentuh.

Canada balsam harus dibuat setipis mungkin, kaca penutup dapat ditekan (secar perlahan) dengan bagian penghapus dari pensil untuk menipiskan Canada balsam. Pada hari berikutnya, kelebihan Canada balsam dapat dibuang dengan cara mengeriknya dengan scalpel.

DAFTAR PUSTAKA

Balbach,M & L.C.Bliss,(1996), A Laboratory manual For Botany,  Saunders collage publishing, New York.

Parjatmo, W., (1993), Panduan Keterampilan Kerja laboratorium, ITB ,Bandung.

Pujawati, E D, (2002), Petunjuk Praktikum Mikroteknik Tumbuhan, Universitas Lambung Mangkurat, Lampung.

Sipahutar, Herbert, (2014), Dasar-dasar Teori Mikroteknik, Universtas Negeri Medan, Medan