Bakteri Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella sp. pertama kali diteliti dan diberi nama oleh bacteriologist Jerman yang bernama Edwin Jklebs (1834 – 1913). Klebsiella sp. merupakan bakteri gram negatif dari famili Enterobactericeae yang dapat ditemukan di traktus gastrointestinal dan traktus respiratori. Beberapa species Klebsiella sp. antara lain Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae dan Klebsiella rhinoscleromatis. Pada manusia, K. pneumoniae hidup secara saprofit dalam sistem pernafasan dan tinja manusia normal sebesar 5%, dengan 1% dapat menyebabkan radang paru – paru. Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, Klebsiella sp. merupakan bakteri fakultatif anaerob.

Klebsiella sp. merupakan kuman berbentuk batang pendek, tidak memiliki spora, dan tidak memiliki flagela. Klebsiella sp. menguraikan laktosa dan membentuk kapsul baik invivo atau invitro dan koloninya berlendir. Kapsul Klebsiella sp. terdiri dari antigen O yang merupakan liposakarida yang terdiri atas unit polisakarida yang berulang. Polisakarida O-spesifik mengandung gula yang unik. Antigen O tahan terhadap panas dan alcohol dan bisa dideteksi dengan aglutinasi bakteri. Antibodi terhadap antigen O terutama adalah IgM. Antigen kedua adalah antigen K. Antigen K ini berada di luar antigen O dan merupakan suatu capsular polysacharida. Antigen K dapat mengganggu aglutinasi melalui antiserum O dan berhubungan dengan virulensi. Kedua antigen ini meningkatkan patogenitas Klebsiella sp.

Klebsiella pneumoniae termasuk genus Kleibsiella dalam family Enterobaceae yang merupakan penghuni normal traktus digestivus. Kuman ini dapat diisolasi dari tinja manusia atau hewan. Pada manusia, genus Klebsiella dapat merupakan kuman penyebab pneumonia, disamping infeksi lain di luar system pernapasan misalnya: ineksi saluran kemih, infeksi nosocomial (Joko,dkk, 2004).

Klebsiella pneumonia adalah anggota keluarga bakteriEnterobacteraceae yang gram negatif, berbentuk batang, non – motil, bakteri berkapsul dan anaerob fakultatif. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan berbagai infeksi yang biasanya menyerang sistem pernafasan dan saluran kemih seperti pneumonia dan infeksi saluran urine (Agustina, 2014).

Kapsul adalah lapisan polimer yang terdapat diluar dinding sel. Kapsul pada bakteri dapat diamati dengan mikroskop dengan teknik pewarnaan, baik secara langsung maupun tidak langsung.

Contoh bakteri yang berkapsul adalah Klebsiella pneumonia. Bakteri ini diteliti dan diidentifikasi pertama kali oleh bakteriologis Jerman bernama

Edwin Klebs. Klebsiella pneumonia terdapat dalam feses dan saluran nafassebanyak 5% pada orang normal. Klebsiella pneumonia salah satu bakteri gram negative, bakteri yang non motil (tidak melakukan pergerakan secara sel), merupakan bakteri fakultatif an aerob, bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan pneumonia (Elfidasari, 2013).

Pada sebagian bakteri, terutama yang hidup dilingkungan alami, dikelilingi oleh suatu lapisan lendir (gelatinous) yang disebut kapsul dan slime. Sebagian besar bakteri mensekresikan suatu lapisan berlendir yang mengakumulasi mengelilingi permukaan luar sel dan menyelubungi dinding sel.

Sebagian ahli berpendapat lapisan lendir merupakan modifikasi dinding sel terluar yang berasal dari penggembungan dan gelatinisasi konstituennya. Sebagian lagi berpendapat bahwa lapisan lendir adalah produk sekretori yang mempunyai komposisi kimia berbeda dengan dinding sel. Clifton menyatakan bahwa lapisan lendir ini disusun oleh karbohidrat yang disimpan disekeliling dinding sel. Bila lapisan ini cukup tebal dan mempunyai bentuk yang jelas, disebut dengan kapsul (Fadilah, 2011).

Media Pertumbuhan

a. Agar Darah

Media ini digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai macam bakteri patogen dan menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut. Media kultur ini kaya nutrien yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri yang optimal. pH media ini sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan menghasilkan media hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar darah seperti nutrien substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar – agar, darah domba.

Media Agar Darah merupakan media differensial yang berfungsi membedakan bakteri berdasar kemampuan bakteri melisiskan sel darah merah. Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona bening disekeliling koloni bakteri. Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu alpha, beta, dan gama. Bakteri yang memiliki tipe hemolisis alpha adalah S. Pneumoniae. Hemolisis alpha terjadi penurunan hemoglobin sel darah merah di sekitar koloni sehingga sekeliling bakteri akan tampak warna hijau atau coklat dalam medium. Hemolisis beta didefinisikan lisis lengkap dengan tampilan warna tranparan disekeliling bakteri pada medium. Bakteri yang termasuk beta hemolisis adalah Streptococcus hemolitik, Streptococcus pyogenes. Tipe hemolisis gamma menunjukan kurangnya tanda hemolisis. Bakteri yang memiliki sifat ini adalah Klebsiella sp., Enterococcus faecalis.

b. Mac Conkey Agar

Media Mac Conkey agar termasuk salah satu media isolasi primer. Mac Conkey merupakan medium selektif differensial yang mengandung zat warna khusus dan karbohidrat untuk membedakan koloni yang memfermentasikan laktosa (bewarna merah jambu) dengan yang tidak memfermentasikan laktosa (tidak bewarna), ukuran dan bentuk koloni bervariasi tergantung species. Kelompok lactosa fermenter seperti Klebsiella sp. menghasilkan koloni bewarna merah jambu pada media isolasi primer. Koloni Klebsiella sp. membentuk koloni yang mukoid, kapsul polisakarida yang besar, kurang motil dan menunjukan positif untuk lisin dekarbosilase dan sitrat. Media Mac Conkey memungkinkan identifikasi persumtif secara cepat pada bakteri interik.Gambaran pertumbuhan Klebsiella sp. pada media Mac Conkey ditunjukkan pada Gambar 3.

c. Media EMB (Eosine Methilen Blue)

Media agar EMB (Eosine Methilen Blue) sebagai media perkembangbiakan yang cukup ideal bagi bakteri gram negatif yang kemudian dapat membedakan warna koloni bakteri yang tumbuh pada cawan biakan, terutama pada koloni Escherichia coli yang dikhawatirkan menjadi bakteri utama yang sering kali tumbuh pada sampel yang terindikasi terkena cemaran.

Media EMB merupakan media selektif yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri gram negatif. Media ini mengandung eosine dan methilen blue yang dapat berfungsi dalam membedakan koloni yang tumbuh pada media tersebut dengan memberikan warna hijau mengkilat yang disebabkan oleh Kristal violet yang terkandung dalam media sehingga dengan mudah dapat membedakan pertumbuhan Escherechia coli yang dikhawatirkan sebagai bakteri kontaminan terbesar pada sampel.

Laktosa dan sukrosa yang terdapat dalam medium ini menyebabkan bakteri Salmonella dan Shigella-lactose dan sucrose negatif dapat dibedakan dengan organisme coliform-lactose positive dan mikroflora lainnya yang bersifat lactose-negative dan sucrose-positive seperti Proteus vulgaris, Citrobacter, atau Aeromonas hydrophila. Pertumbuhan dari mikroorganisme lain yang sejenis, khususnya bakteri Gram-positif, dihambat dengan adanya dyes yang terdapat dalam medium.

Hasil pengujian sampel yang dilakukan terhadap sampel tembakau dan abu rokok dari enam merek rokok menunjukan tidak dijumpainya bakteri Klebsiella pneumonia pada semua sampel rokok yang diujikan (Elfidasari,2013).

Teknik Pewarnaan

a. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan ini tidak akan menembus atau berikatan dengan dinding selbakteri karena daya tolak menolak antara muatan negatif pewarna dan muatan negatif dinding sel bakteri. Pewarna akan membentuk deposit disekitar bakteri atau menghasilkan latar belakang hitam sehingga bakteri tampak tidak berwarna, sementara latar belakangnya berwarna gelap (Harley, 2002).

Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

b. Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak hanya satu jenis larutan zat warna, berbeda dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat warna saja. Pewarnaan diferensial banyak jenisnya, antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan tahan asam, pewarnaan giemsa, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel. Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. fungsi kapsul pada sel bakteri :

 Sebagai makanan cadangan

 Mencegah kekeringan

 Mencegah fagositosis

 Menunjukkan virulensi

 Kapsul sulit diwarnai karena adaya afinitas (daya serap) terhadap cat sangat kecil (Rina,2012).

c. Pewarnaan Gram

            Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum.Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah.

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel

menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi

oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap

mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Pada pewarnaan kapsul metode Burri-Gins, prosedurnya sama seperti pewarnaan negatif tetapi di tambah dengan pewarna karbol fuksin / airfuksin. Karbol Fuksin merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobakteria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropical.

Prosedur Pewarnaan

a. Pewarnaan Gram

·         Alat dan Bahan

1.      Alat

-       Ose Bulat

-       Ose Jarum

-       Rak Tabung

-       Korek Api

-       Lampu Spirtus

-       Inkas

-       Inkubator

-       Tabung Khan

-       Tabung Durham

-       Tabung Reaksi

-       Plate.

2.      Bahan

-       Suspensi Kuman

-       Media Bouillon

-       Media MCA (Mac Conkey Agar)

-       Media EMB (Eosin Methylen Blue)

-       Media Biokimia Reaksi.

a.       Prosedur

1.    Hari Pertama

-          Pembuatan media (Bouillon, MCA, EMB, Biokimia Reaksi)

Dilakukan penanaman pada media pemupuk Bouillon

-          Diinkubasi 37° C selama 24 jam.

2.    Hari Kedua

-          Dari media pemupuk dilakukan inokulasi pada media differensial (MCA) dan media selektif (EMB).

-          Dimasukkan semua alat dan bahan yang diperlukan kedalam inkase

-          Dipanaskan ose bulat sampai merah membara, dinginkan sebentar

-          Diambil suspensi kuman

-          Distreak pada media plate sesuai zona yang sudah dibagi

-          Dipanaskan kembali ose bulat

-          Diinkubasi 37° C selama 24 jam.

3.    Hari Ketiga

-          Dilihat hasil dari media differensial dan media selektif

-          Dilanjutkan dengan pewarnaan Gram :

-          Disiapkan objek glass yang bersih dan kering

-          Di fiksasi

-          Diteteskan PZ sebanyak 1 tetes pada objek glass lalu di flaming

-          Dipanaskan ose bulat sampai membara dengan posisi tegak

-          Diambil koloni kuman satu mata ose pada media padat

-          Letakkan di atas objek glass yang sudah diberi PZ, aduk searah jarum jam, di flaming

-          Di genangi dengan gram I (Gentian Violet) selama 3-5 menit

-          Dicuci dan genangi dengan gram II (Lugol) selama 1 menit

-          Dicuci dan genangi dengan gram III (Alkohol 96%) selama 10-15 detik

-          Dicuci dan genangi dengan gram IV (Fuchsin) selama 3-5 menit

-          Dicuci dan keringkan

-          Diberi 1 tetes oil imersi

-          Diperiksa dibawah mikroskop perbesaran lensa obyektif 100x

·      b.  Pewarnaan Negatif

Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus.Satu ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45^o, kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat dibiarkan hingga mengering dengan sendirinya. Satu tetes minyak emersi diteteskan pada preparat lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan lensa objektif berkekuatan terendah 10X, 40 X lalu diganti dengan lensa objektif berkekuatan 100X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang gelap.

c. Pewarnaan Kapsul

Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus. Satu ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45^o, kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat difiksasi sebanyak 3 kali di atas api. Preparat digenangi pewarna air fuksin selama 5 menit, zat berwarna yang berlebih dibuang lalu dikeringkan dengan kertas saring. Satu tetes minyak emersi diteteskan pada preparat lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan lensa objektif berkekuatan terendah 40 X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang gelap.